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Journal club 2016

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  • Habeck G et al. (2015) The yeast ERAD-C ubiquitin ligase Doa10 recognizes an intramembrane degron. J Cell Biol. 209(4):621 小胞体内に構造異常タンパク質が蓄積すると，小胞体ストレス反応が起こり、分子シャペロンや分解系酵素の発現が誘導される。小胞体の構造異常タンパク質を分解・除去する仕組みの一つが小胞体関連分解：ERAD(Endoplasmic Reticulum-Associated Degradation)である。ERAD では，小胞体内腔と小胞体膜の構造異常タンパク質は分子シャペロンによって識別され、分泌経路から特異的に除外されたのち、トランスロコンを介して細胞質へ逆行輸送されてユビキチン・プロテアソーム系によって分解される。このERADの経路は基質タンパク質の分解シグナルであるデグロンの局在位置によって、３つに分類される。デグロンが細胞質に局在する基質タンパク質を分解する経路はERAD-C、小胞体内腔に局在する場合はERAD-L、小胞体膜中に局在する場合はERAD-Mと呼ばれている。出芽酵母において、ERAD-C経路の基質タンパク質はDoa10複合体によってユビキチン化されて、最終的に分解されることが知られていた。今回の論文では、トランスロコンのサブユニットであるSbh2はユビキチンリガーゼ(E3)Doa10の基質タンパク質であることが分かった。また、Doa10によって認識されるSbh2のデグロンは小胞体膜貫通ドメインと内腔ドメインに位置していること、小胞体膜貫通ドメインに存在するアミノ酸配列68番目のセリンがデグロンの重要な領域であることが明らかになった。これより、Doa10が細胞質側のデグロンだけでなく、小胞体膜中にデグロンをもつ基質タンパク質も認識しユビキチン化を誘導することが初めて分かった。(紹介者　河添)

  • Preissler et al. (2015) Not4‐dependent translational repression is important for cellular protein homeostasis in yeast. The EMBO Journal 34. 1905-1924本論文は、E3ユビキチンリガーゼであるNot4による翻訳抑制がタンパク質のホメオスタシスに重要であることを報告している。細胞内では異常なタンパク質合成を防ぐため、そのクオリティーコントロールは多段階で制御されている。その中でも異常なmRNAの発現を抑える機構に本論文は着目している。通常、転写された異常なmRNAはpoly(A)鎖の除去後、デキャッピングを経て3’末端からのエキソヌクレアーゼあるいは5’末端からのエキソソームによる分解が行われる。しかしながら、異常なmRNAが転写後の分解を受けず翻訳装置まで進んでしまった場合、翻訳中のリボソームに直接作用してタンパク質が分解される機構が近年報告されている(Lu & Deutsch, 2008; Brandman et al., 2012; Charneski & Hurst, 2013)。異常なmRNAの多くはリボソームによりタンパク質合成が開始されたとしても、途中で翻訳が停止してしまう(ストップコドンを持たないnon-stop mRNAの場合、3’末端あるいはpoly(A)鎖の途中まで進行したところで、翻訳が停止してしまう)。この現象はribosome stallingと呼ばれ、途中まで合成された不完全なポリペプチド鎖は速やかに分解されることが報告されている。これまでに、ribosome stallingが起こった場合、翻訳抑制やデアデニル化に関与するCcr4-Not4複合体のコンポーネントであるNot4は不完全なポリペプチド鎖の分解に寄与すると報告されている(Dimitrova et al., 2009)。一方で、Not4は合成途中のポリペプチド鎖のユビキチン化や不完全なポリペプチド鎖の分解には寄与しない、という前者とは相反する報告もある(Bengtson & Joazeiro, 2010; Duttler et al., 2013)。そこで、ribosome stallingを引き起こすことが報告されているポリリジンコード領域を含むレポーター(K12)を用いて、Not4の機能について著者らは検討を行った。その結果、Not4はribosome stallingの際、途中で翻訳が停止した不完全なK12タンパク質の分解には関与しないことを今回著者らは明らかにした。また、Not4はK12 mRNAの翻訳を阻害することで、その発現を抑制していることが新たに見出された。一方、栄養飢餓による翻訳抑制下でもribosome stallingが引き起こされるが、not4Δでは翻訳活性の低下が誘導されにくいことを明らかにした。さらに、not4Δは熱ストレスがかかっていない条件(30℃)下でも、シャペロンタンパク質の発現量が高く、数百種類ものタンパク質が不溶化していた。このことから、not4Δではタンパク質のフォールディングストレスがかかっていることが示唆された。また、デキャッピングに関与するDhh1, Dcp1/2も翻訳抑制に重要であることが報告されているが (Holmes et al., 2004; Coller & Parker, 2005)、これらの変異体でもnot4Δと同様に細胞内でのフォールディングストレスが恒常的に引き起こされていることを明らかにした。以上の結果から、Not4は翻訳が途中で停止した不完全なポリペプチド鎖の分解に関与するのではなく、ribosome stallingしたmRNAの翻訳段階での制御を行っていることが示唆された。さらに、Not4による異常なタンパク質の合成抑制が行われないと、タンパク質フォールディングストレスが誘導されたことからNot4依存の翻訳抑制はタンパク質クオリティーコントロールにおいて重要であることが示された。(紹介者　加藤）

  • Kim and Mark (2015) Stable Pseudohyphal Growth in Budding Yeast Induced by Synergism between Septin Defects and Altered MAP-kinase Signaling, PLoS Genet 11.12 本論文では、セプチンの形成不全とMAP経路の改変が同時に起こることで、出芽酵母の永続的かつ安定したfilamentous growthが誘導されることを報告している。フェロモン応答性のMAPKであるFus3およびセプチンの高次構造形成に関与するprotein kinase Elm1、Gin4、Cla4のいずれかを失った二重欠損により、偽菌糸の形成を誘導されることが示された。Gin4とCla4はセプチンを直接的にリン酸化して正常な高次構造の形成を促し、Elm1はそのGin4とCla4を活性化する。本来、セプチンは出芽途中の細胞のbud neckでリング型の高次構造を形成し、このリングは細胞質周期の進行に伴い母細胞と娘細胞の間で二分される。ところが、gin4∆やcla4∆、elm1∆株ではセプチンのリング構造の形成やリングの分割に異常が生じる。また、今回観察された偽菌糸は、従来知られているものと比較すると、filament形成の程度、Flo8依存性や誘導条件、誘導メカニズムといった点で異なる特徴を示した。これらの結果を踏まえ著者らはelm1Δfus3Δ株などで生じる偽菌糸を特にsadF(septin assembly defect induced filamentation)と名付けている。また著者らは、フローサイトメトリーの結果から、sadFを誘導した細胞ではG2期が延長していることを示し、この細胞周期の遅延がSwe1依存的であることを確認した。また、FM4-64染色では、糸状菌で見られる Spitzenkorperによく似た構造が、娘細胞における極方向の頂点部分で観察されたことから、sadFを誘導した細胞では高度に分極した出芽を形成していることが明らかになった。さらに、sadF growthの誘導はフェロモン応答性およびフィラメント成長経路のMAPKであるKss1依存的シグナル伝達経路を介することを、各種欠損株を用いたレポーターアッセイとウエスタンブロットの結果から明らかにした。今回の解析では直接的な因果関係の解明に至ってはいないが、セプチン高次構造の形成不全がsadF growthを引き起こすことを明らかにした重要な報告である。 (紹介者　穂本）

  • Peters et al. (2015) The Protein Quality Control Machinery Regulates Its Misassembled Proteasome Subunits. PLOS Genetics.　DOI:10.1371/journal.pgen.1005178. プロテアソームを構成するサブユニットに異常が生じた際の、プロテアソームの恒常性は、ユビキチンプロテアソームによる分解と液胞の近傍に形成されるタンパク質封入体の一種であるIPOD (Insoluble Protein Deposit）への隔離によって制御されている事を報告している。プロテアソームのLidを構成するタンパク質であるRpn5のC末端を34残基欠損したタンパク質（Rpn5ΔC）を発現している温度感受性変異株を用いて実験を行った。非制限温度下(30℃)での局在を蛍光顕微鏡で検討したところ、野生型のRpn5は核に局在を示したのに対し、Rpn5ΔCは細胞質側でIPODのマーカータンパク質であるHsp104と共局在を示し封入体に隔離されていることが示唆された。また、制限温度下(34℃)では、Rpn5ΔCは他のLidを構成しているタンパク質Rpn11と細胞質中で共局在することが確認された。さらに、細胞質中ではユビキチン化されたタンパク質が増加していた。つぎに、Native-PAGEでプロテアソームの形成を検討したところ、Rpn5ΔCを発現している株では30℃で19Ｓのサブユニットを1つ欠損したプロテアソームが多く観察され、34℃においてはLidが20Ｓプロテアソームと結合しておらず、正常なプロテアソームの形成が認められなかった。このことから、制限温度下ではプロテアソームのLidの組み立てがRpn5ΔCを発現している細胞では阻害されており、プロテアソームの機能不全が生じていると考えられた。また、野生型のRpn5-RFPとGFP-Rpn5ΔCを共発現している細胞では、GFP-Rpn5ΔCの蛍光が観察されなかったが、プロテアソームの機能を阻害する薬剤であるMG132を加えるとGFP-Rpn5ΔCの蛍光が観察された。このことから、誤って形成されたプロテアソームのサブユニットは正常なプロテアソームによって分解されていることが示唆された。さらに、34℃で、シャペロンであるHsp42とHsp104が、Rpn5ΔCとミスアッセンブルされたLidタンパク質と細胞質中で共局在していることを蛍光顕微鏡観察によって明らかにした。しかし、Hsp42を欠損した株では、Rpn5ΔCが細胞質中ではなく核に局在しており、Native-PAGEによってプロテアソームの形成状態を調べたところ、正常なプロテアソームの形成が確認された。以上のことから、著者らはユビキチンプロテアソームによるミスアッセンブルされたサブユニットの分解と、Hsp42シャペロンによるIPODへの空間的な分離が、プロテアソームを構成するサブユニットに異常が生じた際のプロテアソームの恒常性を制御していることを示した。また、本研究ではC末端領域に欠損を持ったRpn5と他のプロテアソームのLidを構成しているタンパク質が結合しているかを確かめるために、酵母の生育を阻害する薬剤であるMTXを含んだ培地上で、タンパク質断片相補アッセイ（PCA: Protein fragment Complementation Assay）を行った。なおRpn5および他のLidタンパク質のC末端にはMTXに対する耐性を付与するmDHFR(mouse DiHydroFolate Reductase）の異なるサブユニットが結合されており、Rpn5と他のLidタンパク質が結合した場合はmDHFRが形成され、MTXを含んだ培地上でも生育することができるようになる。その結果、C末端を25残基以上欠損したRpn5では他のLidタンパク質と結合できていない事が明らかになった。　（紹介者　糸岡）

  • Schmid et al. (2015) The nuclear polyA-binding protein Nab2p is essential for mRNA production. Cell. 12, 128-139. PolyA鎖結合タンパク質（PABP）Nab2が核内でmRNAのpolyA鎖に結合し、エクソソームによる分解から守ることを紹介した論文。これまでにPABPの3'-end processing における役割や、他のタンパク質との相互作用については多くの知見が得られているが、PABPそのものがmRNAの運命に及ぼす影響は不明な点が多い。著者らはアンカーアウェイシステムを用い、必須PABPであるNab2の核内欠損株を作成した。この手法では、ラパマイシン存在下で機能するタグとその結合ドメインをそれぞれNab2とリボソームタンパク質に融合することで、通常は核に局在するNab2を強制的に細胞質へと隔離できる。Nab2の核内欠損株では、poly(A)+-mRNAが速やかに分解されていた。このPoly(A)+-mRNAレベル減少は、ラパマイシンの副作用、mRNAの転写量減少、RNA polymerase IIの結合量減少や細胞質でのmRNA分解速度の上昇によるものではなかった。一方で、Nab2のpolyA鎖結合ドメイン変異株ではpoly(A)+-mRNAが分解されやすくなり、核内エクソソーム欠損株ではNab2欠損にも関わらずpoly(A)+-mRNAが分解されにくくなったことから、Nab2は核内でpoly(A)+-mRNAに結合し、エクソソームによる分解から保護する役割も果たすことが明らかとなった。今回はNab2を核外に隔離した直後のpoly(A)+-mRNAの挙動を見ているが、長期的にはpoly(A)+-mRNAレベルは回復する結果も得られたので、もう一つの必須PABPであるPab1がNab2の機能を補填するのかもしれない、とも考察している。(紹介者　石田)

  • Huch S et al.(2016) The decapping activator Edc3 and the Q/N-rich domain of Lsm4 function together to enhance mRNAstability and alter mRNA decay pathway dependence in Saccharomyces cerevisiae. Biol Open. 5(10):1388-1399. 細胞内のmRNA分解やその調節は遺伝子発現の適正な制御に関わる主たる要素である。Edc3とLsm4は共にデキャッピング活性化タンパク質であり、以前よりRNAgranules、中でもP-bodyの形成ステップでそれぞれ役割を持つことが知られてきた。また、その2重欠損株はP-bodyを形成することが出来ない事も既に報告されている。本論文において著者らは、この2重欠損において一部の遺伝子をコードするmRNAの半減期が短縮する事を発見した。同時に、デキャッピング酵素(且つP-bodyの構成因子)：Dcp2やデアデニラーゼ：Ccr4、及びDcp2とサブユニットを形成しているDcp1等の発現が増大していた事から、mRNA半減期の短縮はこれらのmRNA分解関連因子の発現バランスが強く関連している事が推察された。また、著者らは他にも、2重欠損株の生育や翻訳の特徴を示しているが、「Edc3とLsm4という2つのデキャッピング因子の変異がmRNAの安定性低下にどのように影響を及ぼしているのか」というメカニズムの部分までは本論文で明確にできていない。　(紹介者　芳本)

  • Sarah et al. (2016) Lifespan control by redox-dependent recruitment of chaperones to misfolded proteins. Cell. 166, 140-151. 過酸化水素ストレスや老化の過程で生じる変性タンパクの蓄積を防ぐ反応は、ペルオキシレドキシンの一種であるTsa1およびTsa1を還元するスルフィレドキシンSrx1を介したレドックス依存的である事を報告している。変性タンパク質が蓄積するとSsa1/2やHsp104と凝集体を形成してリフォールディングや分解・除去をおこなう。そのため、変性タンパク質の蓄積はHsp104-GFPなどをマーカーにして細胞中のfociとして観察する事が可能である。著者らは、tsa1∆欠損株において、熱ストレス下ではSsa1およびHsp104のfociが形成されたのに対し、過酸化水素ストレス下ではfociが形成されない現象を蛍光顕微鏡解析で見出した。また、Tsa1とSsa1/2が構成的に相互作用している事を確認した。一方、Tsa1を構成するN末端から48番目のアミノ酸であるシステイン（C48）は過酸化水素によって酸化されることが知られているが、そのシステインをセリンに置換すると(C48S)過酸化水素によるストレス下でもHsp104のfociが形成されなくなった。さらにsrx1∆欠損株では、過酸化水素によってTsa1が酸化された状態で維持されており、Hsp104もfociを長時間形成したままであった。以上の結果から、過酸化水素によって生じた変性タンパク質の除去には、Tsa1のC48が酸化されることがSsa1/2およびHsp104を変性タンパク質へとリクルートするのに必要であること、変性したタンパク質の凝集体の脱凝集にはSrx1によるTsa1の再還元が必要であることを明らかにした。また、出芽を繰り返した酵母を用いて、老化に伴う変性タンパク質のターンオーバーをみたところ、tsa1∆欠損株ではHsp104と変性したタンパク質の凝集体は形成されず、その形成にはTsa1のC48が酸化される必要があった。このことから、著者らは、老化に伴って形成された変性タンパク質を認識し、取り除く経路は、過酸化水素ストレス下で変性タンパク質を取り除く経路と同じであることを示している。（紹介者　糸岡）

  • Jia-Wei Hsu et al. (2016) Unfolded protein response regulates yeast small GTPase Arl1p activation at late Golgi via phosphorylation of Arf GEF Syt1p. Proc Natl Acad Sci U S A. 113(12):E1683-90 小胞体やゴルジ体などの細胞小器官の間で行われる物質輸送は小胞輸送と呼ばれ、細胞の機能の最も重要なものの一つである。この小胞輸送において、ゴルジ複合体における膜輸送の重要な調節因子であるArl1pはグアニンヌクレオチド交換因子Syt1pによって活性化される。しかし、Syt1pのグアニンヌクレオチド交換因子(GEF)の活性化がどのように調節されているかは明らかになっていない。著者らは小胞体内のミスフォールディングタンパク質の蓄積によって惹起される小胞体ストレス応答シグナルがSyt1のリン酸化を調節することやArl1の活性化に重要であることを明らかにした。これらの発見は小胞体ストレスと小胞輸送がリンクすることを示唆していた。（紹介者　河添）

  • Ramya V, Rajasekharan R. (2016) ATG15 encodes a phospholipase and is transcriptionally regulated by YAP1 in Saccharomyces cerevisiae. FEBS Lett. 590(18), 3155-67. ホスホリパーゼは膜リン脂質の維持に重要な役割を果たすが、まず著者らは出芽酵母において主要な3つのホスホリパーゼBの欠損がリン脂質の加水分解に影響を及ぼさない事を本論文で示した。この事から他のホスホリパーゼの存在が強く示唆されたため、著者らは更にゲノム解析を行い、推定のセリン・ヒドロラーゼモチーフを含む13のタンパク質を特定した。その内の1つであったオートファジーの重要因子：ATG15がホスホリパーゼB 3重欠損株において高い発現量を示し、ホスファチジルセリンを優先して加水分解するホスホリパーゼである事を明らかにした。また更に 、ATG15プロモーターを分析した結果２ヶ所のYap1p結合部位が特定され、Yap1pがATG15プロモーターに結合することでその発現を調節している事が明らかに示された。以上より、オートファジーが細胞内で誘導される際、Yap1pがATG15の発現誘導を担っている事を本論文が初めて明らかにした。 (紹介者　芳本)

  • Jagoda et al. (2016) Copy number variations of genes involved in stress responses reflect the redox state and DNA damage in brewing yeasts. Cell Stress and Chaperones. 21(5), 849-864. ストレス応答に関わる遺伝子のコピー数多型は醸造酵母における酸化還元状態やDNAの損傷に影響を与えることを示した論文。著者らはビール醸造に用いられている酵母のDNAを、遺伝子コピー数の差を蛍光色素のシグナル強度の変化によって検出することのできるarray-CGHを用いて分析し、各株における遺伝子コピー数の変化を明らかにすると共に、GO解析を用いてAAD3やALD2といったストレス応答関連遺伝子ではコピー数の変化が高頻度に生じていることを明らかにした。また、その様なコピー数に大きな変化が生じている株では、細胞内の酸化還元状態の変化とも相関が見られるだけでなく、DNAの損傷や醸造環境下で生じる酸化的ストレスや浸透圧ストレスに対する耐性も低下していることをコメットアッセイやスポットアッセイ等で明らかにした。以上の結果から著者らは、ストレス応答に関わる遺伝子のコピー数多型は醸造酵母における酸化還元状態やDNAの損傷に影響を与えると結論づけた。（紹介者　糸岡）

  • Piña FJ et al. (2016) Reticulons Regulate the ER Inheritance Block during ER Stress. Dev Cell. 37(3):279-88小胞体ストレス存在下で起こる小胞体輸送の阻害はレティキュロンタンパク質が調節していることを出芽酵母を用いて、証明した論文です。以前の研究で著者らは細胞周期を調節する機構として、ERSU経路（ERストレス監視経路）を発見し、小胞体ストレス下でこの経路が娘細胞への小胞体輸送を妨ぎ、細胞質分裂をとめることを報告しました。この論文では、細胞膜および核周囲に存在する小胞体は非対称的に小胞体ストレスに対して反応を示すこと、娘細胞への小胞体輸送はレティキュロンタンパク質とYop1による小胞体の構造の変化に依存していることを証明しています。（紹介者　河添）

  • Neumann et al. (2016) Nuclear Export of Pre-Ribosomal Subunits Requires Dbp5, but Not as an RNA-Helicase as for mRNA Export. PLoS ONE. 11(2), e0149571. DEAD-box型RNAヘリカーゼの一種であるDbp5(Rat8)は、核膜孔複合体(NPC)の細胞質側に存在し、核膜孔を通過するmRNAの正常な核外輸送を担っている。本論文は、Dbp5がmRNAのみならずリボソーム前駆体の核外輸送をも担っている事を報告している。特筆すべき点は、一口に核外輸送といっても、両者に対するDcp5の作用機序が異なる点である。mRNAの核外輸送では、Dbp5は自身のATPase活性を用いてATP依存的に、mRNAに結合しているmRNA核外輸送因子Mex67を解離することにより輸送に方向性をつけている。ところがリボソーム前駆体の核外輸送では、Dbp5自体は正常輸送に不可欠なものの、ATPase活性は不要でMex67もリボソーム前駆体から解離せずその後もずっと結合したままである、という事を本論文が初めて明らかにした。更に、種々のDbp5変異株におけるリボソーム前駆体の局在解析により、「NPCの細胞質側でNup159(NCPコアコンポーネントでmRNA輸送ではDbp5のADPリリースファクターとして働く)とDbp5が結合して正常に局在する」事がリボソーム前駆体正常輸送の最重要条件である事が明らかとなった。このことから、共通の核外輸送関連因子が、異なる物質を異なる機構で核外輸送するという新たなモデルが提示された。(紹介者　芳本)

  • Ahmed et al. (2010) DNA zip codes control an ancient mechanism for gene targeting to the nuclear periphery. Nature. 12, 111-118 遺伝子のpromoter配列に存在するDNA zip code(郵便番号)により、その遺伝子の核内の局在が制御されることを報告した論文。出芽酵母ではストレス等により遺伝子の転写が活性化された遺伝子は核周辺に引き寄せられることが分っていたが、その機構の制御はDNAではなく新生RNAによるものだと考えてられていた。本論文で著者らはイノシトール飢餓で誘導されるINO1遺伝子に着目し、INO1 promoterに存在するGene Recruitment Seqence ：GRSI, II の同定及びGRSI, IIがINO1遺伝子の核膜付近へのリクルートや核膜孔複合体との相互作用に必要であることを明らかとした。更に分裂酵母でもGRS Iは核膜周辺へのリクルートを制御するcis-elementとして機能することを確認した。 (紹介者　石田)

  • Jain et al. (2016) ATPase-modulated stress granules contain a diverse proteome and substructure. Cell. 164, 487-498. 著者らはアザイド(NaN3)やバニリン、熱ショックによって形成されるストレス顆粒(stress granules : SG)は比較的安定な構造を保ち、セルライセート中でもその構造を維持することを新たに見出した。また、SGは均一な構造ではなく、mRNAやG3BPなどのタンパク質がcoreを形成し、その周囲にこれまでに報告されていないような多数のタンパク質がshellを形成していることも明らかにしている。SGを構成するタンパク質としてはDNA/RNA helicase、Hsp42などのヒートショクプロテイン、eIF4AなどのDEAD-box proteinsなどがプロテオーム解析で今回新たに同定されている。さらに、SGの形成にはATPが必要であり、CCTやMCM、RVB ATPaseなどがSGの形成・分解に関与することも明らかとなった。酵母の場合、NaN3やバニリンだけでなく、エタノールやグルコース枯渇でもSGが安定な構造を維持するのか検討が必要だと考えられた。（紹介者　Trinh）

  • Zhiqiang et al. (2015) The Yeast Prion [SWI+] Abolishes Multicellular Growth by Triggering Conformational Changes of Multiple Regulators Required for Flocculin Gene Expression. Cell reports 13.12 2865-2878.本論文では、酵母プリオン[SWI+]がFLO遺伝子の転写活性化因子の構造変化を引き起こし、その結果multicellular growthへの移行が妨げられることが示されている。FLO8を修復したBY4741系統において、[SWI+]を導入した株またはswi1Δではフロキュレーションや偽菌糸形成などのmulticellular growthにおける特徴的な形質が失われた。さらにこのとき、FLO1やFLO11の転写が抑制されることが明らかとなった。これらの結果から、[SWI+]株やswi1Δで生じるmulticellular phenotypeの消失は、FLO1やFLO11の発現抑制に起因すると考えられた。次に、Swi1のクロマチンリモデリング機能に関わるQ-rich regionからC末端側のドメインをYCpベクターで導入すると、swi1Δはmulticellular growthおよびFLO1やFLO11の発現を回復した。一方、[SWI+]株はQC-regionをさらに過剰に発現した場合にのみこれらを回復した。このことから、[SWI+]プリオンによるFLO遺伝子の発現抑制にはSwi1以外の因子の関与が示唆された。アミロイドやプリオンなどのSDS耐性タンパク質凝集体の検出方法の一つであるSemi-Denaturating Detergent Agarose Gel Electrophoresis(SDD-AGE)法や蛍光顕微鏡解析の結果、FLO gene upregulatorであるMss11、Sap30、Msn1が[SWI+]存在下で不活性化し[SWI+]と共凝集していることがわかった。また、このときのMss11の凝集はプリオンに似た挙動を示し準安定的であった。以上の結果から、[SWI+]導入株におけるmulticellular growthの欠失は、[SWI+]存在下でのFLO geneの転写活性化因子の凝集に伴うFLO1、FLO11の発現抑制によって生じるというメカニズムが明らかとなった。(紹介者　穂本)

  • Miller et al. (2015) Compartment-specific aggregases direct distinct nuclear and cytoplasmic aggregate deposition. EMBO J, 34, 778-797. 本論文は、熱ストレスにより形成されるミスフォールドタンパク質の凝集体構造に着目し、その形成に必要なタンパク質(Hsp42, Btn2)の相互関係や凝集体構造へのミスフォールドタンパク質のソーティングについて検討を行っている。ミスフォールドタンパク質の凝集体構造は細胞内の特定の位置：核近傍(juxtanuclear quality control compartment; JUNQ) と細胞質(cytosolic quality contol compartment; CytoQ)に形成される。著者らは、細胞質の核近傍に形成されるとされていたJUNQが実際は核内部に位置していることを明らかにし、これを新たにINQ(intranuclear quality control compartment)と命名した。また、CytoQ内の細胞質ミスフォールドタンパク質もINQへとリクルートされ得ることを明らかにし、これにはHsp104による凝集タンパク質の可溶化、Hsp70のコシャペロンであるSis1や核膜孔複合体のコンポーネントであるNup42などが重要な役割を果たすことを示した。さらに、INQの形成に必要であるBtn2はタンパク質のミスフォールディングによるストレスだけでなく、DNA複製ストレスにより誘導されることを明らかにし、 Btn2がDNAストレスに対しても重要な制御機能を持つことを示唆した。(紹介者　加藤）

  • M Schneider et al. (2015) The nuclear pore-associated TREX-2 complex employs mediator to regulate gene expression. Cell, 162, 1016-1028. 核膜孔複合体上に存在するTREX-2はmRNA輸送に関与することが報告されていたが、本論文ではTREX-2がMediatorとの結合を介して遺伝子の発現も制御することを報告している。TREX-2は五つの因子のうちSac3-Thp1-Sem1で構成されたPCIドメインでRNAやDNAと相互作用する可能性が示唆されていた(Ellisdon et al., 2012)。今回著者らはTREX-2がPCIドメインでMediatorのCoreモジュール(Med31)と会合するだけでなく、MediatorのCoreモジュールとCdk8を中心としたKinaseモジュールとの結合も制御することを見出した。また、Sac3、Med31、Cdk8はRNA polymerase II CTDのSer5の正常なリン酸化と転写開始に、Sac3のPCIドメインは正常なRNA輸送に重要であった。著者らはこのTERX-2の研究が、核膜孔複合体やその結合タンパク質が転写機構に関与する新たな側面の解明につながると考えている。(紹介者　石田)

  • Okada et al. (2013) Daughter cell identity emerges from the interplay of Cdc42, septins, and exocytosis. Developmental cell, 26, 148-161. 本論文では、ライブイメージング法と数理モデルの構築・シミュレーションを組み合わせ、セプチンリング形成から出芽に至る一連のプロセスを明らかにしている。著者らは、Cdc42によって出芽予定位置にリクルートされたセプチンが、負のフィードバックによりCdc42活性を抑制すること、この抑制がCdc42のGAP (GTPase-activating protein)に依存的であること、さらにはセプチンリングの形成にはエキソサイトーシスが必要であることなどを明らかにしている。また、セプチンリングを境界として、エキソサイトーシスの領域がセプチンリングの内側のみに限定されことで出芽形成が誘導されること、セプチンによる母細胞と娘細胞間のバリアによって娘細胞のアイデンティティが確立されることなどを示唆するデータも併せて報告している。（紹介者　穂本）

  • Cho BR, Lee P, Hahn JS.(2014) CK2-dependent inhibitory phosphorylation is relieved by Ppt1 phosphatase for the ethanol stress-specific activation of Hsf1 in Saccharomyces cerevisiae. Mol Microbiol, 3, 306-316. 本論文は、CK2(casein kinase 2)とPpt1(protein phosphatase T)がエタノールストレス下でHsf1の活性化を制御していることを示した。著者らはCK2によるHsf1 S608のリン酸化は、エタノールストレスによるHsf1の活性化を抑制することを明らかにした。一方で、このHsf1の活性化抑制はPpt1によって脱リン酸化されることにより、解除されることを示した。さらに、エタノールストレス下でPPT1欠損とCK2の過剰発現株は複合的にHsf1の活性化を抑制すること、Hsf1 S608AではHsf1の活性化が高まることを見出した。よって、CK2とPpt1によって相互に調節されるHsf1 S608のリン酸化の状態はエタノールストレス下でHsf1の活性を制御するのに重要であることを示唆している。（紹介者　加藤）

  • Kroschwald et al.(2015) Promiscuous interactions and protein disaggregases determine the material state of stress-inducible RNP granules. 　　　　eLife, 4:e06807　「ストレス誘導性のRNP顆粒に及ぼすタンパク質の凝集とシャペロンの影響」…本論文では、出芽酵母のアミロイドおよびstress granule (SG)、P-bodyについて、それぞれ凝集強度に違いがあることを示し、その形成過程について新たな制御機構の存在を提示した。著者等は、SGはアミロイドに次いで凝集力が強固で固体に近い状態であるのに対して、P-bodyは凝集力が弱く液体に近い状態であり細胞質中で融合することを確認している。一方、哺乳細胞のSGやP-bodyは、酵母のものとは異なりどちらも凝集力の弱い構造であることも報告している。アミロイド様の凝集体であるのか否かを判断する方法として、ヘキサンジオール(hexanediol)やThT染色を本論文では採用している。また、RNP構成タンパク質の多くはプリオン様ドメイン(PLD)を持つが、P-bodyやSGが重合・凝集する上でPLDが不可欠であることを本論文では確認している。さらにこの論文では、シビアなストレス下（46˚C）で変性・凝集したタンパク質によってSGの形成が誘導される際にも、PLD やHsp104などのシャペロンがその制御に関わることを明らかにした。ストレスの程度によって、酵母のSGは構成成分にも違いがあることが強く示唆された(46˚Cでは変性凝集タンパク質もSGに含まれている)。グルコース枯渇やエタノール、バニリンなどによって誘導されるSGは、それぞれの構成成分に違いがあるのかもしれない。（紹介者 Trinh）

  • Vera et al. (2014)  The translation elongation factor eEf1A1 couples transcription to translation during heat shock response. eLife, 3, e03164. doi:10.75554/eLife.03164. 熱ショック下の哺乳類細胞(マウス、ヒト由来細胞)において、HSP70 mRNAの転写・安定化・核外輸送・翻訳の各段階で翻訳伸長因子eEF1A1が重要な役割を担っていることを明らかにしている。通常、eEF1AはアミノアシルtRNAをリボソームのA-siteに運搬することで翻訳伸長反応に携わっているが、熱ショック応答時には、HSP70のpromoter内に存在する HSEと転写因子Hsf1の結合を介助することがこれまでに報告されていた(Shamovsky et al., 2006)。本論文では新たに、①熱ショック下でeEF1A1-HSE-Hsf1複合体がRNA polymerase II をリクルートしHSP70 mRNAの転写を活性化すること、②eEF1A1は転写後もHSP70 mRNAの3’UTRに結合しmRNAの分解を防ぐだけでなく、核膜孔複合体構成因子とも相互作用してmRNAの核外輸送を促進すること、③更に細胞質でHSP70 mRNAを効率よく翻訳するのに一役買っていることを明らかにしている。よって、eEF1A1は熱ショック下でHSP70 mRNAに結合し、転写・翻訳を迅速かつ効率的に進める制御因子として働くと著者らは考えている。 (紹介者 石田)

  • Johnson, C. R., Weems, A. D., Brewer, J. M., Thorner, J., & McMurray, M. A. (2015) Cytosolic chaperones mediate quality control of higher-order septin assembly in budding yeast. Mol Biol Cell, 26(7), 1323-1344 　… セプチンは重合性のGTP結合タンパク質であり、セプチンを主成分として分裂溝直下に形成される環状の構造物はセプチンリングと呼ばれる。出芽酵母におけるセプチンリングの主な機能は①出芽に関与する様々な分子が相互作用するための足場となること、②母細胞と娘細胞の間でタンパク質を非対称に分布させる拡散障壁となることだとされている。出芽酵母ではセプチンサブユニットのうち異なる4種類が重合するヘテロオクタマー(Cdc11-Cdc12-Cdc3-Cdc10-Cdc10-Cdc3-Cdc12-Cdc11)を基本単位として、これがさらに高次重合体を形成する。GTP結合ポケット(G interface)に変異が生じた株は熱に対し非常に不安定になることが知られている。しかし、野生型とG interface変異型のサブユニットが共存する場合には、変異型サブユニットはセプチン重合体には組み込まれない。本論文では、セプチンのヘテロ重合体を新規に合成するにあたり、G interface変異型サブユニットが特異的に排除されるクオリティチェックの機構が存在することを見出し、そのメカニズムを検証している。スポットアッセイによりG interface変異型セプチンを発現した株はYdj1(細胞質シャペロンのコシャペロンHsp40)やHsp104の過剰発現によって生育が抑制されることが見出し、さらに変異型セプチンとYdj1あるいはGim3(プレフォールディンタンパク質)間の遺伝学的相互作用を明らかにした。さらにTandem affinity purification (TAP)では変異型セプチンとYdj1との分子間相互作用を確認している。また、分子量によって分画するsize exclusion chromatographyの溶出液をウェスタンブロットにかけた結果、変異型セプチンと同画分にHsp104が存在することが確認された。これらの結果から、セプチンの高次構造が形成される際のクオリティコントロールについてのモデルを著者らは提唱している。リボソームで合成された正常なセプチンサブユニットは、プレフォールディンにより正常に折りたたまれたあと、他のサブユニットと多量体を形成し比較的スムーズに重合がすすむ。一方、G interfaceで不適切なフォールディングが行われる変異型セプチンでは、プレフォールディンのみならずYdj1やHsp104とも相互作用し、多量体化を特異的に遅延させていることが考察されている。本研究はこれまで解析が難しいとされてきたセプチンの物性や制御メカニズムをについて、クオリティコントロールにシャペロンを介するということを見出し、制御機構モデルを提唱している。 (紹介者 穂本)​

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